15.36. PHÁT HIỆN MYCOPLASMA BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY.

 

Nguyên vật liệu

- Mẫu thử nghiệm: Nước nổi nuôi tế bào, hỗn dịch virus, vắc xin bán thành phẩm và thành phẩm.

- Môi trường nuôi cấy: Môi trường lỏng 1: LM1(pH 7,6-7,8; môi trường có  màu đỏ) và môi trường lỏng  2: LM2 (pH 7,2; môi trường có màu vàng cam), dưới dạng 100 ml/chai hoặc 10 ml/ống.

- Môi trường rửa lọc: Môi trường PPLO lỏng.

- Môi trường đặc: Môi trường thạch PPLO.

- Màng lọc 0,1 µm, xy lanh 10 ml và dụng cụ cần thiết đủ cho tiến hành thử nghiệm.

 

Các bước tiến hành

Chuẩn bị môi trường

Pha môi trường LM1 (pH 7,6-7,8): 500 ml

Nước cất pha tiêm: 375 ml

Môi trường PPLO lỏng: 8 g

Đỏ phenol 0,4%: 2,5 ml

Hấp ở 121^OC/15 phút, sau đó thêm 75 ml huyết thanh ngựa,  50 ml Yeast Extract 25%, 6 ml glucose 25% và 1,25 ml  Penicilin G. Trộn đều, ra chai 100 ml và ống thử 10 ml.

Pha môi trường LM2 (pH7,0-7,2): 500 ml

Nước để pha thuốc tiêm: 375 ml

Môi trường PPLO lỏng: 8 g

L - Arginin: 1,5 g

Đỏ phenol 0,4%: 2,5 ml

Hấp ở 121^OC/15 phút sau đó thêm 75 ml huyết thanh ngựa,  50 ml Yeast Extract 25%, và 1,25 ml  Penicilin G , 1 ml acid hydrocloric. Trộn đều, ra chai 100 ml và ống thử 10 ml.

Pha môi trường thạch PPLO: 500 ml

Thạch PPLO: 13,5 g

Nước để pha thuốc tiêm: 375 ml

Hấp tại 121^OC/15 phút sau đó thêm 75 ml huyết thanh ngựa,  50 ml Yeast Extract 25%  và 1,25 ml  Penicilin G. Trộn đều, sau đó đổ thạch ra phiến 6 giếng:  8 ml/giếng, bảo quản 37 ^OC trước khi thử độ nhạy 1 ngày.

Pha môi trường rửa màng lọc:

Môi trường PPLO lỏng: 2,1 g

Nước để pha thuốc tiêm: 100 ml

Hấp ở 121^OC/15 phút.

Các bước tiến hành

- Lọc mẫu: sử dụng xy lanh 10 ml hút 6 ml mẫu thử vào giá lọc 0,1 µm và bơm mẫu qua lọc cho đến hết.

- Rửa lọc: sử dụng 30 ml môi trường rửa lọc và xy lanh 10 ml, bỏ kim, sau đó bơm từ từ cho đến khi môi trường rửa qua hết lọc.

- Tháo lọc, lấy giấy lọc cho vào đĩa petri vô trùng, cắt đôi giấy lọc, cho mỗi nửa giấy lọc vào mỗi chai môi trường LM1 và LM2 đã chuẩn bị sẵn.

- Chai môi trường sau gây nhiễm được nuôi ở 37 ^OC/28 ngày.

- Cấy truyền trên môi trường lỏng: sau gây nhiễm 14 ngày, lấy mẫu từ chai môi trường nuôi cấy chuyển sang ống môi trường nuôi cấy cùng loại: 0,2ml /ống thử, 3 ống thử mỗi loại môi trường và đặt tại 37^OC/14 ngày.

- Cấy truyền trên môi trường đặc: Thạch được chuẩn bị trên phiến 6 giếng, gây nhiễm 10 mcl từ ống thử nghi ngờ lên chính giữa mặt thạch, dán kín phiến và nuôi tại 37 ^OC/10 ngày.

 

Đọc kết quả

- Đọc kết quả lần gây nhiễm đầu tiên: Ngày thứ 28

- Đọc kết quả lần cấy truyền: Ngày thứ 14 trên môi trường lỏng và  ngày thứ 10 trên môi trường thạch;

- Kết quả dương tính khi màu môi trường LM1 chuyển từ màu đỏ sang màu vàng cam; màu môi trường LM2 từ màu vàng cam sang màu đỏ ánh tím và có khuẩn lạc giống hình trứng ốp lếp trên môi trường thạch.

- Kết quả âm tính khi màu môi trường của 2 loại môi trường lỏng không thay đổi giống như ống thử đối chứng và không có khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch.